Ứng dụng công nghệ gen trong phòng trị bệnh trên tôm Sú

1. Tổng quan về nghiên cứu genome tôm sú trên thế giới
– Nghiên cứu genome sẽ cung cấp những thông tin chính xác nhất cho việc xác định các tính trạng quan trọng như: tính kháng bệnh, tính chống chịu đối với điều kiện môi trường, các tính trạng liên quan đến năng suất, chất lượng sản phẩm của tôm. Do kích thước genome tôm sú là rất lớn nên việc giải mã, lập bản đồ gen tôm sú và các loài tôm kinh tế quan trọng khác, như tôm he/thẻ chân trắng, được tiến hành bằng việc giải mã từng phần. Năm 2000, Wilson và đtg đã phân tích trình tự đầy đủ genome ty thể (mtDNA) của tôm sú, với kích thước khoảng 15,9 kb, trong đó có 13 gen mã hóa cho 13 protein, 22 tRNA, 2 rRNA và vùng điều khiển với kích thước khoảng 1 kb.

– Cho đến nay, những hiểu biết cơ bản về sinh học tôm, đặc biệt quan tâm đến sự điều khiển sinh trưởng, sinh sản và hệ thống miễn dịch còn rất hạn chế do thiếu những thông tin về genome của chúng. Một trong các hướng đi quan trọng của nghiên cứu genome tôm sú là phát triển và ứng dụng các chỉ thị phân tử DNA để lập bản đồ gene, phục vụ công tác chọn giống và nuôi. Bằng phương pháp AFLP, Wilson và đtg (2002) đã công bố bản đồ di truyền liên kết genome tôm sú. Tuy nhiên, bản đồ này có mật độ thấp, chỉ bao gồm 20 nhóm liên kết với tổng khoảng cách là 1,412 cM. Năm 2005, Wuthisuthimethavee và đtg đã lập bản đồ liên kết di truyền dựa trên các chỉ thị DNA vệ tinh (microsatellite marker). Bản đồ này bao gồm 9 nhóm liên kết với tổng khoảng cách là 103,6 cM. Nghiên cứu gần đây nhất, You và đtg (2010) đã xây dựng bản đồ di truyền dựa trên 256 chỉ thị microsatellite maker và 85 AFLP marker. Kết quả đã phát hiện ra 43 nhóm liên kết ở tôm đực và 46 nhóm liên kết ở tôm cái. Bản đồ di truyền của tôm đực gồm 176 microsatellite marker và 49 AFLP marker cách nhau ~11,2 cM với tổng chiều dài genome là 2.033,4 cM. Bản đồ di truyền của tôm cái gồm 171 microsatellite marker và 36 AFLP marker cách nhau ~13,8 cM với tổng chiều dài genome là 2182 cM. Các microsattelite marker tiếp tục được nghiên cứu, phát triển để lập bản đồ di truyền liên kết và ứng dụng trong chọn giống tôm sú.

cong nghe gen

– Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của các phương pháp sinh học phân tử hiện đại, nhiều nghiên cứu về gen và genome tôm, đặc biệt là những phân tích các đoạn trình tự gen biểu hiện (Express Sequence Tag – EST) đã đạt được nhiều kết quả góp phần làm sáng tỏ một số cơ chế phân tử liên quan đến sinh trưởng, sức sinh sản và khả năng kháng bệnh. Một trong những dự án giải mã genome tôm sú lớn nhất cho đến nay là dự án giải mã EST/cDNA genome tôm sú của Thái Lan do Trung tâm Công nghệ Sinh học (BIOTEC, Thái Lan) thực hiện trong 5 năm (từ năm 2003 đến 2008). Cơ sở dữ liệu EST của tôm sú sẽ tạo ra nguồn thông tin di truyền quan trọng để xác định các marker phân tử như: microsattelite và SNP, lập bản đồ di truyền liên kết phục vụ cho mục đích chọn tạo giống tôm. Kết quả của dự án này cho đến nay đã thiết lập được hơn 10.000 dòng EST từ 15 thư viện cDNA từ các loại mô khác nhau của tôm sú trong các điều kiện bình thường và bất lợi để xác định các gen đặc hiệu mô và các gen đáp ứng với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi (bị nhiễm bệnh, tác động của các yếu tố nhiệt độ, môi trường…). Trong đó, nhóm nghiên cứu cũng đã xác định được 997 EST có chứa các microsattelite marker của tôm sú, 74 locus được xác định nằm trong vùng các gen đã biết chức năng.

2. Nghiên cứu gen liên quan đến khả năng miễn dịch ở tôm sú
– Phương pháp phân lập và phân tích các đoạn trình tự gen biểu hiện (Expressed sequence tag, EST/ cDNA) là một trong các phương pháp sinh học phân tử hiện đại nhằm tập chung nghiên cứu các gen chức năng. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về cDNA/EST của genome tôm sú đã đạt được một số kết quả góp phần làm sáng tỏ một số cơ chế phân tử liên quan đến sinh trưởng, sức sinh sản và khả năng kháng bệnh. Từ năm 1999, Lehnert và các tác giả khác đã thiết lập thư viện EST từ các bộ phận đầu ngực, cuống mắt và chân bơi của tôm sú và xác định được 60 gen mới. Sau đó, hàng loạt gen liên quan đến miễn dịch của tôm sú cũng được phân lập và xác định trình tự bằng phương pháp phân tích cDNA/EST. Dự án giải mã cDNA/EST của các nhóm nghiên cứu ở Thái Lan đã tạo cơ sở dữ liệu EST quan trọng từ 15 thư viện cDNA ở các mô khác nhau của tôm sú thường và tôm sú bị gây nhiễm virus.

– Những nghiên cứu về phản ứng tế bào và dịch thể ở tôm khi bị nhiễm virus đã được các nhà khoa học rất quan tâm, đặc biệt là xác định và phân tích đặc điểm của các nhân tố tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch. Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của các phương pháp sinh học phân tử hiện đại, những nghiên cứu liên quan đến hệ miễn dịch ở tôm cũng đạt được nhiều kết quả góp phần làm sáng tỏ cơ chế phân tử của quá trình này. Từ các chương trình giải mã cDNA/ EST của một số loài tôm như tôm thẻ chân trắng (P. vanamei) và tôm sú (P. monodon) đã xác định được trình tự của hàng loạt gen liên quan đến hệ miễn dịch. Ở tôm sú, nhiều gen liên quan đến miễn dịch đã được phân lập và xác định trình tự bằng cách sử dụng kỹ thuật RT-PCR. Trong đó, mộ số gen liên quan đến cơ chế miễn dịch đã được quan tâm nghiên cứu như: protein Rab7 liên quan đến cơ chế xâm nhiễm của virus; syntenin tham gia vào con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào; hemocyanin có hoạt tính phenoloxidase liên quan đến khả năng kháng khuẩn, kháng nấm; protein Ran có chức năng liên quan đến cơ chế thực bào; protein caspase được cho là tác nhân trung tâm điều khiến cơ chế apoptosis, nhiều hệ thống protein kháng virus, kháng khuẩn cũng đã được phân lập như gen mã hóa protein kháng virus (PmAV), gen mã hóa các yếu tố kháng khuẩn như anti – lipopoysacharide (ALF), penaeidin, crustin… Những gen này đã và đang được tiếp tục nghiên cứu nhằm chứng minh chức năng và vai trò của chúng trong cơ chế bảo vệ cơ thể.

3. Tiềm năng ứng dụng của gen liên quan đến miễn dịch trong phòng trị bệnh ở tôm sú
– Phương pháp phòng và điề u trị các bệnh ở tôm sú do vi khuẩn, vi nấm, ký sinh trùng và virus được sử dụng phổ biến là điều khiển môi trường nuôi tôm, sàng lọc tôm giống, sử dụng các hóa chất, chất kháng sinh và các chất kích thích miễn dịch. Hiện nay, công nghệ sinh học trong thủy sản phát triển, nhiều gen liên quan đến miễn dịch ở tôm sú đã được phân lập và nghiên cứu ứng dụng trong điều trị bệnh. Các giải pháp được các nhà khoa học quan tâm đó là việc tạo ra các peptide kháng khuẩn tái tổ hợp, sử dụng kỹ thuật RNAi và tạo các protein vỏ của WSSV tái tổ hợp.

– Peptide kháng khuẩn (Antimicrobial peptide – AMP) là các phân tử tự nhiên có phổ hoạt tính rộng chống lại nhiều vi sinh vật, dễ tạo ra và rất ít tạo nên sự kháng. Một vài AMP đã được dùng trị bệnh và sử dụng trong thương mại. Các AMP có hoạt tính tiềm năng chống lại nhiều nguồn bệnh của động vật dưới nước, sử dụng các peptide này để điều khiển và ngăn chặn bệnh. Ở loài giáp xác, một số AMPs đã được xác định như ở cua biển (Carcinus maenas), peptide kháng khuẩn này có kích thước khoảng 11,5 kDa và có khả năng kháng lại vi khuẩn Gram (+). Một số họ AMPs chính được phát hiện ở tôm sú, tôm thẻ chân trắng, tôm thẻ Đại tây dương (Litopenaeus setiferus) và tôm thẻ Trung Quốc (Fenneropenaeus chinensis) là penaeidin, crustin và yếu tố khá ng khuẩ n (anti-lipopoysacharide factor – ALF) có khả năng kháng nấm, kháng vi khuẩn và virus. Các họ AMP này lại có nhiều lớp, isoform, khác nhau.

– Hoạt tính sinh học của ALF ở tôm đã được mô tả theo khía cạnh hoạt động kháng khuẩn chống lại biên độ rộng của các vi sinh vật. Hoạt tính kháng khuẩn của ALFPm2 (ALF ở tôm sú isoform 2) tái tổ hợp (recombinant ALFPm2 – rALFPm2) được kiểm tra là kháng E.coli và B. megaterium. ALFPm3 tái tổ hợp (recombinant ALFPm3 – rALFPm3), một loại ALF ở tôm sú dạng (isoform) 3 thuộc nhóm I bộc lộ hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Gram (-) và (+) cũng như nấm. Đáng chú ý, rALFPm3 có phổ hoạt tính kháng nhiều loại vi khuẩn và nấm bao gồm cả V. harvey – một vi khuẩn gây bệnh cho tôm nuôi. rALFPm3 giết chết V. harvey ở nồng độ ức chế tối thiểu (MIC – minimum inhibitory contrentration) là 0,78 – 1,56 uM, trong khi đó kháng sinh được tổ chức thực phẩm và thuốc (FDA -Food and Drug Administration) chấp nhận sử dụng trong nuôi trồng thủy sản là oxytetracyline, có thể giết chết vi khuẩn ở MIC 72,1 – 90,3 uM.

– Họ crustin có 3 lớp đều có các peptide được nghiên cứu tái tổ hợp. CrustinPm1 (Crustin ở tôm sú dạng 1) có hoạt động kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Gram (+) bằng sự ức chế mạnh mẽ chống lại Staphylococcus aureus và Staphylococcus iniae. Crus-likePm (Crustin-like antimicrobial peptide – peptide kháng khuẩn tương tự crustin ở tôm sú) tái tổ hợp cũng cho thấy hoạt động kháng khuẩn đối với cả vi khuẩn Gram (+) và (-) bao gồm cả V. harveyi. SWDPm2 (single whey acidic protein domain Penaeus monodon 2) tái tổ hợp biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Gram (+). Chưa có công bố nào về penaeidin tái tổ hợp từ tôm sú, nhưng pen2 (penaeidin dạng 2) và pen3 (penaeidin dạng 3) tái tổ hợp tạo ra từ tôm thẻ chân trắng, được chứng minh có một phổ kháng nấm và kháng khuẩn Gram (+). Pen3 có phạm vi rộng và chống lại hiệu quả hơn các loài vi khuẩn. Tuy nhiên, pen3 có rất ít hoặc không có hoạt tính chống lại vi khuẩn Gram (-), pen5 (penaeidin dạng 5) ở tôm thẻ Trung Quốc có chứa hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Gram (-), vi khuẩn Gram (+) và nấm.

– Nghiên cứu ALFPm3 tái tổ hợp từ tôm sú chỉ ra rằng ALF có ảnh hưởng đến khả năng lây nhiễm và ức chế sự tiếp xúc của virus với các tế bào tạo máu. Ở tôm càng (Macrobrachium rosenbergii), ALF có thể hoạt động trong giai đoạn virus xâm nhập vào tế bào chủ. Cơ chế ức chế này hiệ n nay vẫn chưa được làm rõ. Hoạt tính chống sự lây nhiễm WSSV của rALFPm3 được kiểm tra ở cả trong in vitro và in vivo. Tiêm rALFPm3 và WSSV vào tế bào gan nuôi cấy của tôm đã làm giảm đáng kể sự sinh sản của virus. Hiện nay, công nghệ sinh học đang phát triển một cách vượt bậc, các gen mã hóa cho peptide kháng khuẩn ở động vật thủy sản nuôi được phân lập và ứng dụng vào sản xuất một lượng lớn peptide kháng sinh trong phòng trị bệnh truyền nhiễm. Nhằm nâng cao giá trị sản phẩm và tăng hiệu quả kinh tế trong nuôi trồng thủy sản, peptide kháng khuẩn tái tổ hợp là một bước tiến mới trong việc tìm ra và thay thế hóa chất, kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản. Trong các gen liên quan đến chức năng miễn dịch được nghiên cứu, nhiều peptide được phân lập và chứng minh có chức năng kháng nấm và ký sinh trùng. Do đó, các peptide tái tổ hợp cũng sẽ là một trong các giải pháp mới trong phòng trị bệnh nấm và ký sinh trùng ở tôm.

– Kỹ thuật can thiệp RNA (RNAi) cung cấp một cơ chế bảo vệ mà tôm có thể đáp ứng với tác nhân gây bệnh. Các công bố mới gần đây ở tôm đã chứng minh rằng dsRNAs và siRNA tham gia vào quá trình chống WSSV ở tôm. Robalino và đtg (2007) là nhóm nghiên cứu đầu tiên chứng minh rằng dsRNA tạo nên sự bảo vệ kháng WSSV ở tôm thẻ chân trắng. Các dsRNA tương ứng với các gen mã hóa cho protein VP28, protein kinase của WSSV cho thấy sự bảo vệ ở tôm sú. Tiêm RNA can thiệp ngắn (siRNA): VP15-siRNA hoặc VP28-siRNA cũng cho thấy hiệu quả kháng WSSV ở tôm sú. Mặt khác, khi ức chế biểu hiện của PmRab7 (gen Rab7 ở tôm sú) bằng cách tiêm dsRNA đặc trưng vào tôm sú nhiễm WSSV và YHV, người ta thấy mRNA VP28 của WSSV cũng giảm mạnh. Điều này chứng tỏ rằng PmRab7 đóng vai trò trong sự tái bản của WSSV và YHV. Gần đây nhất, Attasart và đtg (2009) đã chứng minh sự kết hợp sử dụng dsRNA ribonucleotide reductase tiểu đơn vị nhỏ của ribosome với Rab7 hoặc không kết hợp đều giúp tôm sú có khả năng sống sót đến 95% so với đối chứng. Điều này chứng tỏ rằng, dsRNA cho ribonucleotide reductase cũng có khả năng ức chế sự tái bản của WSSV.

– Ngoài ra, nhóm nghiên cứu Yi và đtg (2004) đã chứng minh protein vỏ của WSSV VP28 liên quan đến quá trình xâm nhiễm vào cơ thể tôm, chịu trách nhiệm gắn lên các thụ thể bề mặt tế bào chuyên biệt. Bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng chống VP28 để trung hòa VP28 và ngăn chặn quá trình xâm nhiễm của virus. Mặt khác, tôm có thể có khả năng miễn dịch “thụ động” chống lại WSSV bằng cách sử dụng các protein cấu trúc VP19 và VP28 tái tổ hợp được cho rằng có thể bảo vệ tôm sú chống lại WSSV. Những protein này được biểu hiện nhiều ở vi khuẩn, côn trùng, sau đó được tinh chế và cho “ngâm” với tôm, tiêm vào tôm bằng vacine đường miệng ở dạng vi khuẩn biểu hiện protein tái tổ hợp được phủ bởi thức ăn cho tôm hoặc chiết xuất tạo thức ăn dạng viên. Đặc biệt, trường hợp sử dụng vacine protein vỏ VP28 của WSSV cho thấy tỷ lệ sống sót đáng kể chống lại sự lây nhiễm WSSV so với lô đối chứng, điều này có thể dẫn đến sự phát triển của một loại vacin thương mại. Những kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra tiềm năng chống lại WSSV ở tôm sử dụng các protein cấu trúc của WSSV. Tuy nhiên, cơ sở phân tử của hiện tượng “miễn dịch” hoặc “cơ chế kháng” ở tôm vẫn chưa được biết đến.

Ứng dụng công nghệ gen trong phòng trị bệnh trên tôm sú, Nguồn: Luận án Tiến sỹ Sinh học (Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú – Th.s Hoàng Thị Thu Yến).

BÌNH LUẬN

Làm ơn để lại binh luận của bạn
Để lại tên của bạn tại đây